Эпигенетическая ДНК диагностика

Компания «Лаборатория эпигенетической ДНК диагностики» занимается разработкой нового поколения эпигенетических ПЦР тестов для выявления онкологических заболеваний на ранних стадиях.

В наших тестах осуществляется анализ ДНК из венозной крови с использованием стандартного оборудования для ПЦР в реальном времени.

Что же делает наши тесты особенными?

Мы анализируем маркеры метилирования ДНК, считающиеся наиболее перспективными для выявления рака на ранних стадиях, но наш метод анализа метилирования абсолютно новый.

Анализ основан на использовании нового типа ферментов, ранее открытого командой ученых компании SibEnzyme — метил-зависимых ДНК эндонуклеазах или MD ДНК эндонуклеазах. Новые ферменты по своим свойствам очень похожи на обычные эндонуклеазы рестрикции, но в противоположность им режут только метилированную ДНК. Это делает их удобным инструментом для эпигенетических исследований. Дополнительная информация

Два абсолютно новых метода анализа ДНК:  GLAD-ПЦР анализ и GlaI-ПЦР-анализ — для эпигетического анализа препаратов ДНК из клинических образцов. Позволяет определять наличие даже нескольких молекул метилированной ДНК (сайта R(5mC)GY) или неметилированной ДНК (сайта RCGY) соответственно в образце с избыточном количеством неметилированной или метилированной ДНК.  Дополнительная информация

 

Фрагментация геномной ДНК ферментом GlaI с последующим NGS позволяет строить профили метилирования для больных и здоровых доноров. Сравнение данных профилей позволяет с легкостью находить сайты R(5mC)GY — потенциальные эпигенетические маркеры, которые могут использоваться в диагностике. Больше информации

В наших тестах мы используем ДНК легкой фракции клеток крови. Ее очень легко получить с помощью обычной настольной центрифуги и солевого раствора. Никаких дополнительных реагентов и минимальное время обработки.  Дополнительная информация

Новый тип ферментов — Метилзависимые ДНК эндонуклеазы

Метилзависимые сайт-специфичные ДНК эндонуклеазы (МД эндонуклеазы) — новый класс ферментов открытый в SibEnzyme (Россия).

Эти ферменты очень напоминают обычные рестриктазы по своим биохимическим свойствам. Принципиальное же их отличие — они режут только метилированную ДНК. Это свойство делает МД-эндонуклеазы очень удобным инструментом для эпигенетического анализа.

В настоящее время коммерчески доступно 9 различных МД-эндонуклеаз.  Сайты узнавания этих ферментов отличаются не только по структуре, но и по паттерну метилирования. Ко всему прочему они могут разрезать ДНК в сайте узнавания различными способами.

Особым свойством обладает фермент GlaI — его сайт узнавания R(5mC)GY является продуктом de novo метилирования метилазы DNMT3. Это свойство превращает GlaI в удобный инструмент для эпигенетической ДНК диагностики.

Известные применения:

  • GLAD-ПЦР анализ — детекция наличия сайта R(5mC)GY в заданной точке
  • GlaI-ПЦР анализ — количественное определение уровня метилирования в заданной точке
  • EpiSeq — for detection of R(5mC)GY sites in whole genome

 

 

Заказывайте МД эндонуклеазы на сайте SibEnzyme или напишите нашим менеджерам yf адрес nsk@sibenzyme.ru для получения дополнительной информации.

GLAD-ПЦР анализ — определение метилирования ДНК в заданной точке без бисульфитной обработки

GLAD-ПЦР анализ (GlaI hydrolysis and Ligation Adapter Dependent PCR) позволяет определить наличие сайта 5′-R(5mC)GY-3′ в заданной точке ДНК человека или млекопитающего.

GLAD-ПЦР анализ включает три простых шага и выполняется в 1 пробирке [3] (см. анимацию ниже):

  1. Гидролиз ДНК ферментом GlaI
  2. подшивка универсального адаптера
  3. ПЦР в реальном времени с флюоресцентным зондом.

НЕ ТРЕБУЕТ БИСУЛЬФИТНОЙ ОБРАБОТКИ ДНК!

Новый метод может использоваться для определения метилирования целевого сайта в минимальных количествах (5 и более копий) в условиях присутствия фонового количества неметилированных сайтов.

Метод может применяться для ДНК, полученной из различных источников: тканей, биопсий, крови, плазмы, сыворотки и т.д.


GLAD-ПЦР анализ

The abnormal de novo DNA methylation is performed by DNMT3A and DNMT3B DNA methyltransferases. These enzymes recognize and methylate site 5’-RCGY-3’ with formation of 5’-R(5mC)GY-3’/3’YG(5mC)R-5’[1]. Recently discovered site-specific methyl-directed DNA-endonuclease GlaI recognizes exactly this DNA sequence 5’-R(5mC)↓GY-3’/3’YG↓(5mC)R-5’ and cleaves it as indicated by arrow [2]

Инновации и преимущества

В сравнении с традиционными методами анализа метилирования ДНК GLAD-ПЦР анализ:

  • Простой – 3 простых шага в одной пробирке, требует обычную РВ-ПЦР машину
  • Быстрый — всего 3-4 часа
  • Чувствительный – определяет от 5 копий метилированного сайта в образце
  • Надежный — ложно-положительные результаты отсутствуют
  • Количественные — существуют протоколы для качественного и количественного анализа

Все эти факторы делают GLAD-ПЦР анализ очень удобным для эпигенетической ДНК диагностики

Ограничения традиционных методов

Главными проблемами при метилчувствительной ПЦР (MSP), основанной на бисульфитной конверсии ДНК, являются неполная конверсия, что ведет к ложно положительным результатам, или деградация ДНК при избыточной обработке.

Методы анализа, основанные на метил-чувствительных эндонуклеазах рестрикции таких как пара MspI-HpaII дают положительный результат только при отсутствии гидролиза HpaII. Таким образом, этот метод является косвенным. Кроме того, анализируемый сайт является второстепенным и не связан с de novo метилированием ДНК, происходящем при возникновении различных заболеваний.

Primers and TaqMan probes

For GLAD-PCR assay reaction you will need 1 TaqMan probe and 2 primers: genomic and hybrid.

GLAD-PCR primers and probes

Genomic primer and TaqMan probe located near 5’-R(5mC)↓GY-3’ site of interest are designed as usual [4].

Hybrid primer is a DNA sequence 5’-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3’, wherein 5’-end of
15-nucleotide primer corresponds to universal adapter and tetranucleotide part at the 3’-end (underlined) is complementary to the genomic sequence at GlaI hydrolysis point. This structure implies the existence of 32 variants of hybrid primers corresponding to different possible terminal sequences after GlaI hydrolysis of all possible variants of NNR(5mC)↓GY sequence.

All primers and probes may be ordered at SibEnzyme along with the GLAD-PCR assay kit order. Otherwise, you can order a synthesis of primers and TaqMan probe somewhere else.

GLAD PCR Assay of two R(5mC)GY sites in human genome are used as an example of the method application.
Mixes of TaqMan Probes and primers for analysis of only these two R(5mC)GY sites are included:

  1. «Control URB1 mix (primers + TaqMan probe)» is provided for analysis of A(5mC)GT site in regulation region of URB1 gene. Position of this site (according to a human  genome assembly GRCh38/hg38) is 32334291-32334294 in chromosome 21.
  2. «Control CEBPD mix (primers + TaqMan probe)» is provided for analysis of G(5mC)GC site in regulation region of CEBPD gene. Position of this site (according to a human  genome assembly  GRCh38/hg38) is 47738502-47738505 in chromosome 8.

GLAD-PCR assay kit

For researchers convenience we developed a kit for 200 or 1000 GLAD-PCR reactions in 2/10 96-wells PCR plates. All reagents are included except primers and TaqMan probe. The sequences of TaqMan Probe and primers are determined by a customer based on DNA sequence around the RCGY site of interest.

Reaction requires:

  • sample DNA
  • genomic primer and TaqMan probe designed for RCGY site of interest
  • hybrid primer — includes a constant part (complimentary to the universal adapter) and tetranucleotide (complimentary to DNA at the point of GlaI hydrolysis).

Please order GLAD-PCR assay kit at SibEnzyme site or connect with SibEnzyme managers at info@sibenzyme.com for information how to order at your country.

Detailed info on kit in GLAD-PCR assay kit instruction manual

GlaI-qPCR assay — Determination of DNA methylation without bisulfite treatment

GlaI-PCR assay  allows to determine 5′-R(5mC)GY-3′ site in selected position of human and mammalian genomic DNA.

GlaI PCR assay includes two steps and is carried out in one tubes [3] (see animation below):

  1. GlaI hydrolysis of studied DNA
  2. subsequent real-time PCR with Taqman probe of original and hydrolised DNA

NO BISULFITE CONVERSION!

A new method of GLAD PCR assay is used to determine a selected 5′-R(5mC)GY-3′ site in a human/mammalian DNA at minimal quantities (5 and more copies) in a presence of excess of unmethylated DNA. It is perfect for epigenetic DNA diagnostics in routine laboratory and clinical practice.

It may be applied to any source of DNA: tissues, biopsies, blood, plasma, serum, etc


GlaI-PCR assay steps

The abnormal de novo DNA methylation is performed by DNMT3A and DNMT3B DNA methyltransferases. These enzymes recognize and methylate site 5’-RCGY-3’ with formation of 5’-R(5mC)GY-3’/3’YG(5mC)R-5’[1]. Recently discovered site-specific methyl-directed DNA-endonuclease GlaI recognizes exactly this DNA sequence 5’-R(5mC)↓GY-3’/3’YG↓(5mC)R-5’ and cleaves it as indicated by arrow [2]

Innovative aspects and main advantages

In comparison with other methylation detection methods GlaI-PCR has strong advantages:

  • Simple – 2 easy steps in one tubes and requires only real time PCR-machine
  • Quick — only 3-4 hours
  • Sensitive – detects from 5 copies of unmethylated DNA
  • Quantitative — may be used to detect % of methylation

All these factors make GlaI-PCR-Assay to be a very attractive for epigenetic diagnostics

Limitations of traditional methods

The main problem in methylation-specific PCR (MSP), based on bisulfite conversion of DNA, is incomplete conversion which causes false-positive results, or DNA degradation in case of overtreatment.

Primers and TaqMan probes

For GlaI-PCR assay reaction you will need 1 TaqMan probe and 2 primers.

primers

Genomic primers and TaqMan probe located near 5’-RCGY-3’ site of interest are designed as usual [4].

All primers and probes may be ordered at SibEnzyme along with the GlaI-PCR assay kit order. Otherwise, you can order a synthesis of primers and TaqMan probe somewhere else.

GlaI PCR Assay of two R(5mC)GY sites in human genome are used as an example of the method application.
Mixes of TaqMan Probes and primers for analysis of only these two RCGY sites are included

GlaI-PCR assay kit

For researchers convenience we developed a kit for 200 or 1000 GlaI-PCR reactions in 2/10 96-wells PCR plates. All reagents are included except primers and TaqMan probe. The sequences of TaqMan Probe and primers are determined by a customer based on DNA sequence around the RCGY site of interest.

Reaction requires:

  • sample DNA
  • genomic primers and TaqMan probe designed for RCGY site of interest

Please order GlaI-PCR assay kit at SibEnzyme site or connect with SibEnzyme managers at info@sibenzyme.com for information how to order at your country.

Detailed info on kit in GlaI-PCR assay kit instruction manual

EpiSeq — new method of NGS preparation for DNA methylation profiling

While developing an epigenetic diagnostics the main interest of researchers is positions of de novo DNA methylation sites in the genome — potential methylation biomarkers. De novo DNA methylation is produced by DNMT3A and DNMT3B DNA methyltransferases. These enzymes recognize and methylate 5’-RCGY-3’ site with formation of 5’-R(5mC)GY-3’/3’YG(5mC)R-5’[1]. Thus, there are 4 possible variants of R(5mC)GY site: A(5mC)GC, A(5mC)GT, G(5mC)GC, G(5mC)GT.

A new method of R(5mC)GY sites profiling in the whole genome – EpiSeq developed by SibEnzyme – includes 4 steps:

  1. DNA fragmentation: GlaI hydrolisys produces fragments with blunt ends
  2. DNA fragments size select: 150-700 fragments selection
  3. Illumina paired-end 75-150 bp sequencing using usual reagents
  4. Fragments mapping to Human genome reference. Fragment ends correlates with R(5mC)GY positions

Detailed method description see in articles [12, 14]

Key facts and advantages

  1. simple — just replace ultrasound fragmentation by GlaI hydrolysis, fragments ends correspond to DNA methylation points
  2. 4-6 Gb of data usually is enough for 1 profile; 15-20 samples per 1 HiSeq run
  3. covers about 3.5 mln of 7 mln possible de novo DNA methylation RCGY sites within genome

Limitations of traditional methods

The most comprehensive data may be obtained with the whole genome bisulfite sequencing (WGBS) method. However, this is rather expensive and laborious technologically; therefore, this method is not used widely.

In practice the less expensive RRBS (reduced representation bisulfite sequencing) method may be applied, which determines sequences of only short, converted MspI genomic fragments, nevertheless covering a big number of CpG islands.

The progress in DNA chip technologies based on bisulfite conversion also should be mentioned. For instance, Infinium MethylationEPIC BeadChip Kit allows to determine the status of methylation for more than 850,000 CG sites in a single experiment. However, the selection of tested bases is too subjective and assay is too expensive.

The common disadvantages of the methods with a bisulfite treatment are a possible incomplete conversion and a high level of DNA degradation. Besides they include several additional stages and are rather sophisticated.

EpiSeq kit is being prepared for orders, GlaI is commercially available. Please order GlaI at SibEnzyme site or connect with SibEnzyme managers at info@sibenzyme.com for information how to order at your country or for more details.

New DNA source from the venous blood

Light fraction of the blood cells is a good source of DNA for our PCR tests. Easy to get this fraction – one standard table centrifuge, no reagents except saline and minimal time of manipulation with a blood. This simplicity allows us to avoid most problems and mistakes of medical stuff which are usual when working with ctDNA or cfDNA. See usage of method at [13]

Conferences, patents and publications

Method presentation at scientific conferences:

  1. Cancer Epigenetics 2017, Osaka, Japan, October 2017, poster presentation Study of DNA methylation associated with Lung Cancer: GLAD-PCR Assay of R(5mC)GY sites
  2. Cancer Epigenetics 2017, Osaka, Japan, October 2017, poster presentation Comparative analysis of RCGY sites methylation in the genomes of Raji and U-937 malignant and normal lung fibroblast cell lines
  3. Global Cancer Summit 2017, Kuala Lumpur, Malaysia, March 2017, oral presentation GLAD-PCR assay of R(5mC)GY sites in aberrantly methylated regulation regions of tumor-suppression genes in lung cancer
  4. 43th ISOBM annual congress, September, 2016, Chicago, USA, oral presentation GLAD-PCR assay of DNA methylation markers associated with colorectal cancer
  5. Global Cancer Summit 2015, Bangalore, India, oral presentation “GLAD-PCR assay of R(5mC)GY sites in aberrantly methylated regulation regions of tumor-suppression genes in colorectal cancer
  6. Cancer Epigenomics 2015, San-Francisco, USA, poster presentation “Determination of R(5mC)GY sites in regulation regions of tumor-suppression genes by GLAD-PCR assay in colorectal cancer
  7. Cell Symposia Cancer Epigenomics, Barselona, Spain, October, 2013, Poster presentation GLAD PCR analysis of aberrant DNA methylation in cancer

Related articles and patents:

  1. Handa, V., and Jeltsch A. “Profound sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the human epigenome” // 2005, J. Mol. Biol. 348, 1103-1112
  2. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9:7
  3. Kuznetsov V.V., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Degtyarev S.Kh. Method of determining nucleotide sequence Pu(5mC)GPy at predetermined position of continuous DNA // Patent RU 2525710 C1
  4. A.G. Akishev, M.A. Abdurashitov, V.L. Sitko, N.A. Netesova, I.F. Radaeva, E.A. Nechaeva, S.Kh. Degtyarev “GLAD-PCR assay of selected R(5mC)GY sites in URB1 and CEPBD genes in human genome” // Res J Pharm Biol Chem Sci, 8(1): pp.465-475, 2017
  5. A.A. Evdokimov , N.A. Netesova , N.A. Smetannikova , M.A. Abdurashitov, A.G. Akishev , B.S. Malyshev , E.S. Davidovich , V.V. Fedotov , V.V. Kuznetsov , Y.D. Ermolaev , A.B. Karpov , A.E. Sazonov , R.M. Tahauov, S.Kh. Degtyarev GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer // Biol Med (Aligarh) , 8:7(2016)
  6. A.A. Evdokimov, N.A. Netesova, N.A. Smetannikova, M.A. Abdurashitov, A.G. Akishev, E.S. Davidovich, Yu.D. Ermolaev, A.B. Karpov, A.E. Sazonov, R.M. Tahauov, S.Kh. Degtyarev Application of GLAD-PCR assay for determination of the methylation sites in the regulatory regions of tumor-supressors gene ELMO1 and ESR1 in colorectal cancer // Problems in oncology, #1, 2016 p.116-120
  7. Alexander G. Akishev, Danila A. Gonchar, Murat A. Abdurashitov and Sergey Kh. Degtyarev Epigenetic typing of human cancer cell lines by BlsI- and GlaI-PCR assays // “Ovchinnikov bulletin of biotechnology and physical and chemical biology” V.7, No 3, pp 5-16, 2011
  8. D. A. Gonchar, A. G. Akishev, S. Kh. Degtyarev BlsI- and GlaI-PCR assays – a new method of DNA methylation study // “Ovchinnikov bulletin of biotechnology and physical and chemical biology” V.6, No 1, pp 5-12, 2010
  9. V.A. Chernukhin, T.N. Najakshina, M.A. Abdurashitov, J.E. Tomilova, N.V. Mezentzeva, V.S. Dedkov, N.A. Mikhnenkova, D.A. Gonchar, S.Kh. Degtyarev A novel restriction endonuclease GlaI recognizes methylated sequence 5’-G(5mC)^GC-3’ // Biotechnologia (russ.). 2006. N 4. P. 31-35
  10. A.A. Evdokimov, M.V. Kulak, N.A. Netesova, N.A. Smetannikova, M.A., Abdurashitov, A.G. Akishev, B.S. Malyshev, E.S. Davidovich, V.V. Fedotov, A.B. Karpov, S.Kh. Degtyarev GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer // Tumor Biology, Vol.37, supplement 1, Sept. 2016, s6-s7
  11. Abdurashitov M.A., Tomilov V.N., Gonchar D.A., Dubinin E.V., Degtyarev S.Kh. “Mapping positons of methylated sequences Pu(5mC)GPy along continuous DNA for epigenetic profile creation and identification of aberrant DNA methylation sites” // Patent RU 2586502 C1
  12. Abdurashitov M.A., Tomilov V.N., Gonchar D.A., Kuznetsov V.V., Degtyarev S.Kh. Mapping of R(5mC)GY Sites in the Genome of Human Malignant Cell Line Raji // Biol Med (Aligarh) Volume 7, Issue 4, BM-135-15 (2015)
  13. А.N. Кuksova, V.L. Sit’ko, M.A. Abdurashitov, A.G. Akishev, N.A.Netesova, I.V. Vihlyanov, M.K. Nikitin, A.B. Karpov, S.Kh. Degtyarev GLAD-PCR assay of methylation of ACGC site in position Chr11: 65647266 in DNA samples from the blood cells of healthy donors and early stage renal cancers Epigenetic DNA diagnostics, vol.1, 2019 doi: 10.26213/SE.2019.11.40307 Accessed 11 Nov 2019
  14. Abdurashitov M.A.,  Tomilov V.N.,  Gonchar D.A.,  Snezhkina A.V., Krasnov G.S., Kudryavtseva A.V., Degtyarev S.Kh. Comparative Analysis Of RCGY Sites Methylation In Three Human Cell Lines. Epigenetic DNA diagnostics, vol.1, 2019 doi:26213/SE.2019.76.40116 Accessed 11 Nov 2019

Related PDF files

  1. Methyl-directed DNA Endonucleases
  2. GLAD-PCR assay
  3. GLAD PCR assay Kit
  4. Early Cancer Detection
  5. Determination of R(5mC)GY sites in regulation regions of tumor suppression genes by GLAD-PCR assay in colorectal cancer